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【摘要】目的研究鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與耐藥基因之間的關(guān)系。方法用VITEK-2型全自動(dòng)微生物分析儀,檢測(cè)331株鮑曼不動(dòng)桿菌和42株多重耐藥菌的藥敏情況,用PCR方法檢測(cè)多重耐藥菌的耐藥基因。結(jié)果鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)21種抗生素的平均耐藥率分別為59.8%和62.8%；對(duì)頭孢曲松、頭孢唑啉和頭孢替坦的耐藥率均為100%；42株多重耐藥菌株（100%）對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯、頭孢唑啉、頭孢替坦和氨芐西林完全耐藥,且均檢測(cè)有TEM-1和ampC基因;38株多重耐藥菌均檢測(cè)到TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因。結(jié)論鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院重要致病菌,且多重耐藥率很高，與攜帶的TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】鮑曼不動(dòng)桿菌;多重耐藥基因;耐藥基因檢測(cè)

StudyonantibioticsresistanceandresistantgenesofAcinetobacterbaumannii

XUJing-feng，XU-Lin,FANWei-hong.GeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,Beijing100700，China

【Abstract】ObjectiveObjectiveTostudytherelationshipbetweenantibioticresistanceandresistantgeneofAcinetobacterbaumannii.MethodsTheantibioticresistanceandresistantgenewasdeterminedbypolymerasechainreaction（PCR）andwithWHONET5.0in331strainsand42strainsmultiresistanceofAcinetobacterbaumannii.ResultsTheresistanceratesofAcinetobacterbaumanniitoceftriaxone、cefotetan、cefazolinwere100%andtoImipenem、meropenemwere23.5%,38.3%respectively.42strainswereidentifiedasmultiresistantisolateswithpresenceofTEM-1andampCgene;38strainswereidentifiedasmultiresistantisolatesofTEM-1、ampC、aac（3）andgyrAgene.ConclusionThemultiresistanceofAcinetobacterbaumanniihascloserelationtoconcomitantpresenceofTEM-1、ampC、aac（3）andgyrAgene.

【Keywords】Acinetobacterbaumannii;drugmultiresistant;drugresistantgenedetection

鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院獲得性肺炎的重要致病菌,且很容易在監(jiān)護(hù)病房流行。由于鮑曼不動(dòng)桿菌在自然界的廣泛存在及其復(fù)雜的耐藥機(jī)制,對(duì)β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類以及喹諾酮類抗生素已呈現(xiàn)多重耐藥，給臨床治療其所致感染帶來很大困難。為能更好地指導(dǎo)臨床選擇合適的抗生素，本文對(duì)本院2005～2006年住院患者標(biāo)本分離的331株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行藥敏分析,并對(duì)2006年分離的42株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的基因進(jìn)行測(cè)序和研究,現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1菌株來源331株鮑曼不動(dòng)桿菌均為我院臨床標(biāo)本中分離并按全國統(tǒng)一操作規(guī)程［1］。標(biāo)本主要包括血液、尿液、痰和其他分泌物。

1.2儀器試劑VITEK-2型全自動(dòng)微生物分析儀、ID-GN鑒定卡、AST-GN09藥敏卡由法國Bio-Merieux公司生產(chǎn);VITEK比濁計(jì)（V1210）由日本生產(chǎn)；PCR擴(kuò)增儀為美國PERKINELMER公司9600型基因擴(kuò)增儀；日本三洋MDF型超低溫冰箱;德國Hettich公司22R型低溫超速離心機(jī);美國水套式恒溫培養(yǎng)箱。

1.3菌種鑒定、藥敏所有實(shí)驗(yàn)菌株分離純化后按VITEK-2的使用要求配制成菌懸液和稀釋液,分別填充到ID-GN和AST-GN09卡中,用VITEK-2儀器自動(dòng)完成細(xì)菌的鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.4質(zhì)控菌株由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌（ATCC25922）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）,藥敏質(zhì)控結(jié)果符合NCCLS藥敏質(zhì)控要求。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理［2］細(xì)菌耐藥性分析用WHONET5軟件進(jìn)行分析，耐藥率顯著性差異用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,兩組耐藥率比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。

1.6耐藥基因的檢測(cè)采用堿裂解法和蛋白酶K法提取被測(cè)細(xì)菌的質(zhì)粒和染色體基因,提取方法根據(jù)不同引物設(shè)立不同PCR條件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大腸埃希菌分別作SHV型和TEM型陽性對(duì)照；其余ampC、PER-1、OXA-23基因陽性對(duì)照均為北京華明公司基因檢測(cè)室經(jīng)基因測(cè)序后比對(duì)的陽性菌株。

1.7PCR耐藥菌基因［3］根據(jù)GenBank提供的耐藥基因，采用Primer軟件設(shè)計(jì)引物（見表1）。反應(yīng)體系均為25μl,其中緩沖液2.5μl,10mmol/L4×dNTP0.5μl,50μmol/上下游引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超純水18.75μl。根據(jù)不同引物設(shè)立不同PCR反應(yīng)條件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型陽性對(duì)照，以TEM-26型大腸埃希菌作TEM型陽性對(duì)照,產(chǎn)物經(jīng)電泳,在紫外線下觀察結(jié)果,并在凝膠上成像。表1用于檢測(cè)各種耐藥基因的引物（略）

2結(jié)果與分析

2.1鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床分布本文鮑曼不動(dòng)桿菌均來源于本院的住院病人，其中2006年160株,按標(biāo)本分為血（6株）、痰（136株）、尿（6株）和其他分泌物12株；2005年171株,按標(biāo)本分為尿（5株）、痰（82株）和其他分泌物（89株）。

2.2鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用5大類21種抗生素的藥敏結(jié)果見表2。2006年和2005年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)21種抗生素的平均耐藥率分別為62.8%和59.8%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無顯著性（P>0.05）。2006年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢曲松、頭孢唑啉和頭孢替坦的耐藥率均為100%；對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛鈉和頭孢呋辛酯的耐藥率分別為57.7%、44.6%、98.0%和98.0%；對(duì)β內(nèi)酰胺和碳青霉烯類如氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐藥率分別為100%、48.3%、54.4%、17.7%和75.8%，對(duì)亞胺培南和美洛培南的耐藥率分別為23.5%和38.3%。2005年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢曲松和頭孢替坦的耐藥率均為100%；對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯和頭孢唑啉的耐藥率分別為43.9%、37.2%、92.1%、92.1%和96.5%；對(duì)β內(nèi)酰胺和碳青霉烯類如氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐藥率分別為100%、49.5%、55.2%、15.2%和86.9%，對(duì)亞胺培南和美洛培南的耐藥率分別為28.9%和34.9%。2006和2005年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)呋喃妥因的耐藥率均為100%，對(duì)左旋氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為8.4%、21.5%和75.4%、54.4%。表2鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗生素的耐藥率（略）注：2006與2005年的耐藥率比較，※P<0.05

2．3多重耐藥菌的藥敏結(jié)果從2006年分離的42株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)18種抗生素的藥敏結(jié)果見表3。42株（100%）菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢呋辛鈉、頭孢呋辛酯、頭孢唑啉、頭孢替坦和氨芐西林完全耐藥,35株（83%）菌株對(duì)氨曲南耐藥；25株（60%）菌株對(duì)亞胺培南敏感,23株（55%）菌株分別對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素和美洛培南敏感,17株（40%）菌株對(duì)慶大霉素和哌拉西林敏感。

2．4耐藥基因檢測(cè)在42株多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中,均檢測(cè)有TEM-1和ampC基因,5株（12%）檢測(cè)到ESBLs,說明鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素有極高的耐藥性;38株（90%）多重耐藥菌均檢測(cè)到TEM-1、ampC、aac（3）和gyrA型基因;19株（45%）檢測(cè)有TEM-1、PER型基因。所有菌株均未檢出SHV、PER-1、VEB-1、IMP、VIM、OXA-23、OXA-24型基因（圖1）。表342株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的藥敏結(jié)果（略）

2.5測(cè)序結(jié)果將PCR型陽性擴(kuò)增產(chǎn)物做雙向基因測(cè)序,并與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的相關(guān)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,所有與產(chǎn)超廣譜酶的目標(biāo)基因（Z21957）的PCR產(chǎn)物同源性為100%;將OXA-23型PCR擴(kuò)增陽性的4份標(biāo)本產(chǎn)物做單向測(cè)序,結(jié)果與OXA-23產(chǎn)碳青霉烯酶基因（AF201828）序列的同源性達(dá)到99%；另8份Ampc酶PCR陽性產(chǎn)物作單向測(cè)序,結(jié)果與染色體介導(dǎo)的高產(chǎn)Ampc酶目標(biāo)基因（AJ009979）的同源性為100%;6份gyrA型基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與目標(biāo)基因（X82165）比對(duì)顯示,在83位點(diǎn)的絲氨酸均被亮氨酸取代。

3討論

3.1本組鮑曼不動(dòng)桿菌85%來自呼吸道標(biāo)本，說明不動(dòng)桿菌雖然是呼吸道的寄居菌，但在人體內(nèi)成為優(yōu)勢(shì)菌時(shí)，也能引起呼吸道感染，而且可導(dǎo)致多臟器、多系統(tǒng)感染,尤其容易發(fā)生于危急重癥病人。大量廣譜抗生素的應(yīng)用,使耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌得到優(yōu)勢(shì)生長,也成了鮑曼不動(dòng)桿菌肺部感染的危險(xiǎn)因素。

3.2本組鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用5大類21種抗生素的平均耐藥率為59.8%和62.8%，對(duì)頭孢曲松等5種頭孢菌素和氨芐西林的耐藥率幾乎達(dá)100%，對(duì)亞胺培南和美洛培南也有23.5%和38.3%的耐藥率，說明本組鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的多重耐藥性。

3.3本組鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦加酶抑制劑的耐藥率為48.3%和49.5%，明顯低于氨芐西林100%的耐藥率。對(duì)哌拉西林/他唑巴坦加酶抑制劑的耐藥率僅為17.7%和15.2%，說明舒巴坦和他唑巴坦均能有效抑制β內(nèi)酰胺酶。由于鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥主要是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，而且不動(dòng)桿菌極易經(jīng)質(zhì)粒結(jié)合,并與多種耐藥質(zhì)粒共存?？梢允琴|(zhì)粒介導(dǎo)的TEM-1和TEM-2β-內(nèi)酰胺酶,也可以由染色體介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶，或由于青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）的改變等原因?qū)е履退?。所以本組鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨芐西林加舒巴坦后的耐藥率由100%降至48.3%，對(duì)哌拉西林加他唑巴坦后的耐藥率由54.4%降至17.7%。因此在對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療時(shí),可選用加舒巴坦或他唑巴坦的β內(nèi)酰胺類抗生素。不加酶抑制劑的抗生素已不適合臨床應(yīng)用，不能作為經(jīng)驗(yàn)用藥。

3.4鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生耐藥的機(jī)制比較復(fù)雜,且多重耐藥率很高，還能誘導(dǎo)革蘭陰性桿菌產(chǎn)ESBLs與高產(chǎn)AmpC酶的作用［4］。在本組42株多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中,均檢測(cè)有TEM-1和ampC基因,5株（12%）檢測(cè)到ESBLs,說明鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素有極高的耐藥性。尤其AmpC酶的普遍存和過量表達(dá)，表現(xiàn)出對(duì)β-內(nèi)酰胺酶極高的水解活性,可水解第三代頭孢菌素。由于AmpC酶為非誘導(dǎo)酶,無論誘導(dǎo)劑是否存在,均可高產(chǎn)此水解酶。所以在抗感染治療中，要嚴(yán)格禁止隨意使用第三代頭孢菌素，以防止或延緩各種高耐藥株細(xì)菌的產(chǎn)生與蔓延。

3.5本組多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌均產(chǎn)生氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶［aac（3）-1和aac（3）-2］,而普通株均不產(chǎn)該酶,說明aac（3）基因與鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥有密切關(guān)系。另外,由gyrA和gyrB分別編碼的2個(gè)A或B亞單位是喹諾酮類藥物靶位的DNA旋轉(zhuǎn)酶,其主要功能是催化革蘭陰性菌的DNA超級(jí)結(jié)構(gòu)。是否耐藥取決于DNA旋轉(zhuǎn)酶的1個(gè)或2個(gè)基因點(diǎn)的突變,本組多重耐藥株在83位點(diǎn)上的絲氨酸（TCA）被亮氨酸（TTA）取代是喹諾酮類藥物的耐藥原因。

3.6本研究說明,鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥與同時(shí)產(chǎn)TEM型廣譜酶,高產(chǎn)AmpC酶,aac（3）基因編碼的氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶和gyrA基因編碼的DNA旋轉(zhuǎn)酶突變有密切關(guān)系。

【參考文獻(xiàn)】

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4BouG,OliverA,Martinez-BeltranJ.OXA-24,anovelclassDbeta-lactamasewithcarbapenemaseactivityinanAcinetobacterbaumanniiclinicalstrain.AntimicrobAgentsChemother,2000,44（6）:1556-1561.