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基因治療有望成為治療遺傳病、腫瘤、病毒感染及其它難治性疾病的有效手段，但目前基因轉(zhuǎn)移方法的局限性成為實(shí)現(xiàn)這一希望的最大障礙。非病毒學(xué)的基因轉(zhuǎn)移方法效率較低；已用于人體試驗(yàn)的基因治療方案絕大多數(shù)是以病毒學(xué)方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體最為成熟。常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體從小鼠白血病病毒(MLV)改造而來(lái)，雖可使目的基因整合至靶細(xì)胞基因組、實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，但只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，目前主要用于基因治療的離體方案；腺病毒載體既能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，亦可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也較高，但目的基因不整合至靶細(xì)胞基因組，僅能短暫表達(dá)，而且腺病毒本身某些抗原的表達(dá)可引起人體免疫反應(yīng)，阻止其重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)；其它一些病毒載體如腺相關(guān)病毒(AAV)載體、單純皰疹病毒(HSV)載體亦因各種原因不能令人滿意。

理想的病毒載體能同時(shí)提供高效的基因轉(zhuǎn)移、長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)及生物安全性。近來(lái)，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型為人免疫缺損病毒(HIV-1)為代表的慢病毒。研究表明［1-5］，以HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的這類慢病毒載體具有可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，適于體內(nèi)基因治療，因此有望成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體。本文即對(duì)該類載體的研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)介。

1HIV-1基因組的基本結(jié)構(gòu)［6］

HIV-1DNA前病毒的主要結(jié)構(gòu)基因及其排列形式與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，均為5′LTR-gag-pro-pol-env-3′LTR。其中g(shù)ag基因編碼病毒的核心蛋白，pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，pro基因則編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶。與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒不同的是，HIV-1基因組尚有較多調(diào)節(jié)基因，其中屬于HIV-1基因復(fù)制所必需的tat基因和rev基因，分別編碼兩個(gè)反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程中發(fā)揮重要作用，后者則可促使HIV-1基因的表達(dá)由早期向晚期轉(zhuǎn)化。非HIV-1復(fù)制所必需的調(diào)節(jié)基因有nef、vif、vpr和vpu。這些基因的編碼產(chǎn)物都有各自的功能，有些尚未完全闡明，在此不一一贅述。

2構(gòu)建HIV-1載體系統(tǒng)的基本原理［7］

HIV-1載體系統(tǒng)由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能，需盡量減少二者的同源性，如將包裝成分上5′LTR換成巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子、3′LTR換成SV40polyA等。包裝成分通常被分開(kāi)構(gòu)建到兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。圖1所示為T(mén)rono等建立的HIV-1載體系統(tǒng)中的一種［1］。將包裝成分與載體成分的3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如人腎293T細(xì)胞)，即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無(wú)復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。

3HIV-1載體系統(tǒng)的改進(jìn)

近年來(lái)，已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立了復(fù)制缺陷的HIV-1載體系統(tǒng)，用于不同目的的研究，如分析病毒的感染力［8］、篩選抗病毒藥物［9］、評(píng)價(jià)Env糖蛋白的不同區(qū)域在介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞中的作用［10］等。而目前對(duì)于以基因治療為目的的HIV-1載體系統(tǒng)，研究的焦點(diǎn)集中在如何擴(kuò)大其嗜性范圍、確保其安全性及提供其滴度和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力上。1996年以來(lái)，Trono領(lǐng)導(dǎo)的課題組發(fā)表了一系列令人鼓舞的研究結(jié)果［1～3］，主要包括以下幾方面的改進(jìn)。

3.1包膜蛋白

最初的HIV-1載體顆粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，僅對(duì)CD4+的細(xì)胞具有親嗜性。1996年，Trono課題組的Naldini等［1］設(shè)計(jì)的HIV-1載體系統(tǒng)(見(jiàn)圖1)采用表達(dá)水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的質(zhì)粒和雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的質(zhì)粒，分別取代表達(dá)HIV本身包膜蛋白Env的質(zhì)粒，使HIV-1載體顆粒包上了VSV或雙嗜性MLV的包膜。這樣做的結(jié)果至少具有三個(gè)方面的積極意義：①包膜的更換進(jìn)一步降低了HIV-1載體恢復(fù)成野生型病毒的可能；②使HIV載體感染宿主的范圍不再僅限于CD4+細(xì)胞，而擴(kuò)大到幾乎能感染所有組織來(lái)源的細(xì)胞；③VSV的包膜賦予HIV載體顆粒高度的穩(wěn)定性，使其能夠通過(guò)超速離心而濃縮，達(dá)到高滴度。Naldini等已使HIV-1載體滴度由105轉(zhuǎn)錄單位(TU)/ml達(dá)到108TU/ml。這樣的改進(jìn)無(wú)疑是HIV載體系統(tǒng)走向應(yīng)用而邁出的一大步。

3.2包裝成分

包裝成分的構(gòu)建應(yīng)在不影響重組病毒的裝配和感染力的前提下，盡可能地減少無(wú)關(guān)的HIV-1蛋白的表達(dá)，為野生型病毒的恢復(fù)設(shè)置障礙。Naldini等［1，2］在構(gòu)建包裝質(zhì)粒pCMVΔR9和pCMVΔR8.2時(shí)，分別在env基因閱讀框架前插入了多個(gè)終止密碼子或刪除了env基因中1.4kp的序列，代之以終止密碼子，以阻止env基因的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，Zufferey等［3］將包裝包裝質(zhì)粒上表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4個(gè)基因分別刪除或聯(lián)合刪除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們對(duì)于產(chǎn)生HIV-1載體顆粒是非必需的，即使完全刪除，得到的載體顆粒仍具備轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞的能力。這4個(gè)調(diào)節(jié)蛋白或已被證實(shí)、或被高度懷疑是構(gòu)成HIV毒性的因素［11，12］，將其刪除、加上包膜蛋白的替換，可使制備HIV載體過(guò)程中產(chǎn)生野生型病毒的可能必微乎其微。

3.3載體質(zhì)粒

載體質(zhì)粒上HIV-1的順式序列通常包括兩端的LTR、剪切位點(diǎn)及包裝信號(hào)Ψ等。此外，研究表明［7］，gag基因5′端的序列可提高載體RNA的包裝效率；Rev蛋白需要與Rev反應(yīng)元件(RRE)相作用，將未剪切的載體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿。因此，Naldini等［1～3］在載體上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了產(chǎn)生載體顆粒的能力。對(duì)于載體上需含有多少順式作用序列為最佳，目前尚不完全靖楚。

4HIV-1載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)

迄今，Trono課題組構(gòu)建的HIV-1載體系統(tǒng)已在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、鼠成纖維細(xì)胞(208F)、原代培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞、人呼吸道上皮細(xì)胞等，結(jié)果表明［1-5］，HIV-1載體無(wú)論對(duì)分裂細(xì)胞還是非分裂細(xì)胞均能轉(zhuǎn)導(dǎo)，但對(duì)非分裂細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與細(xì)胞所停止的周期有關(guān)。HIV-1載體對(duì)G0期細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不如對(duì)靜止于G1/S或G2期的效率高，停止于G0期的時(shí)間越長(zhǎng)，這種差別越大。這可能是由于某些G0期細(xì)胞內(nèi)脫氧核苷酸濃度低、影響了反轉(zhuǎn)錄步驟，造成報(bào)告基因未表達(dá)所致的表觀現(xiàn)象。實(shí)際上，HIV-1載體有的已進(jìn)入到G0期的靶細(xì)胞內(nèi)，建立了轉(zhuǎn)錄中間體。一旦這類細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，載體所攜帶的基因就會(huì)表達(dá)。

在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Naldini等［1］將HIV載體注射成年大鼠腦組織，30天后取腦組織，未觀察到病理變化，免疫組化顯示報(bào)告基因能夠在終末分化的神經(jīng)元中表達(dá)，證明HIV載體對(duì)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移是有效的。此后，他們將重組病毒在轉(zhuǎn)導(dǎo)前用dNTP和多胺處理，以增加病毒內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可使對(duì)大鼠神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄數(shù)率提高2倍，報(bào)告基因可表達(dá)3個(gè)月以上［2］。Miyoshi等［4］將攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的HIV載體注射大鼠眼球，GFP能在感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素細(xì)胞中表達(dá)，如果以視紫質(zhì)啟動(dòng)子控制GFP，則可在感光細(xì)胞中特異地高表達(dá)。

對(duì)于HIV-1載體進(jìn)入非分裂細(xì)胞后的表達(dá)是否全部由整合形式產(chǎn)生，目前尚有不同意見(jiàn)。Naldini等［2］將包裝質(zhì)粒中的整合酶基因突變，如此而產(chǎn)生的HIV載體不能在非分裂細(xì)胞中表達(dá)，因此認(rèn)為HIV載體的表達(dá)全部由整合形式產(chǎn)生；而Goldman等［5］卻在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中測(cè)到了HIV載體前病毒的非整合形式，認(rèn)為不能排除兩種形式同時(shí)存在的可能。

在用HIV-1載體已經(jīng)進(jìn)行的所有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中［1～5］，未出現(xiàn)過(guò)有復(fù)制力的HIV，說(shuō)明其安全性是有保證的。

5HIV載體的基因治療中的應(yīng)用前景

5.1獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的基因治療［7，13］

目前對(duì)于AIDS的基因治療方案，基本上是以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的方式，將抗病毒基因體外導(dǎo)入CD4+T淋巴細(xì)胞或CD34+的造血祖細(xì)胞，再回輸體內(nèi)。常用的抗病毒基因包括自殺基因、反義RNA、核酶、RNA誘餌的相應(yīng)DNA序列以及調(diào)節(jié)蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白的突變體基因等。由于這些治療基因不能到達(dá)巨噬細(xì)胞和多能干細(xì)胞，困此難以重建免疫；此外，體外操作費(fèi)用昂貴，不適于大規(guī)模應(yīng)用。

HIV-1載體的研究為AIDS的基因治療帶來(lái)了新的希望，它可能具有以下優(yōu)勢(shì)：第一，利用HIV-1本身包膜蛋白Env包裹的載體顆?？梢詫⒖共《净蛑苯舆\(yùn)抵CD4+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，適于直接的體內(nèi)治療，而包被了VSV包膜的載體顆粒又能感染多能干細(xì)胞，有利于免疫重建；第二，患者體內(nèi)的野生型HIV-1可將攜帶抗病毒基因的載體拯救出來(lái)，使載體擴(kuò)增并擴(kuò)散到周圍更多的細(xì)胞中發(fā)揮抗病毒作用；第三，如果將抗病毒基因置于HIV-1本身的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)控制之下轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，則只有當(dāng)HIV-1感染該細(xì)胞時(shí)，Tat蛋白反式激活LTR中的TAR元件，抗病毒基因才會(huì)表達(dá)，使基因表達(dá)具有了靶向性。

5.2神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療［1，2，14］

Lesch-Nyhan綜合征是一種遺傳性的代謝性腦病，由編碼次黃嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一種退行性腦病，由于產(chǎn)生多巴的神經(jīng)元退化，導(dǎo)致大腦紋狀體內(nèi)多巴胺水平降低，臨床上給患者注射左旋多巴可改善癥狀，但長(zhǎng)期注射及藥物的副作用令患者難以承受。較為理想的方式是在腦內(nèi)持續(xù)表達(dá)酪氨酸羥化酶(TH)，使其催化酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)闉樽笮喟?；Alzheimer氏病也是一種多因素引起的退行性腦病，造成大腦皮質(zhì)和海馬回神經(jīng)元萎縮，通常采用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子防止神經(jīng)元退化。由于HIV-1載體能夠體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元并建立長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，因此對(duì)于以上疾病的基因治療非常具有吸引力?？梢栽O(shè)想，分別將編碼HPRT、TH或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因通過(guò)HIV-1載體介導(dǎo)，體內(nèi)注射至神經(jīng)元，有可能對(duì)上述疾病產(chǎn)生良好效果。

5.3血液系統(tǒng)疾病的基因治療［15］

造血干細(xì)胞一直被認(rèn)為是對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤或其它疾病(如地中海貧血、鐮刀性紅細(xì)胞貧血、血友病等)進(jìn)行基因治療的理想靶細(xì)胞，但由于缺乏使目的基因在造血干細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的方法，這方面的研究進(jìn)展不明顯。盡管小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)細(xì)胞因子刺激后進(jìn)入細(xì)胞周期的造血干細(xì)胞，但經(jīng)此處理的干細(xì)胞性質(zhì)可能會(huì)發(fā)生改變。HIV載體則可通過(guò)直接轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止的干細(xì)胞避免這類問(wèn)題。將多藥耐藥(MDR)基因?qū)朐煅杉?xì)胞，可使其耐受大劑量化療，可能成為治療白血病和其它惡性腫瘤的有效途徑；將正常珠蛋白基因或凝血因子Ⅷ、Ⅸ分別導(dǎo)入造血干細(xì)胞，有望對(duì)地中海貧血、鐮刀性紅細(xì)胞貧血和血友病產(chǎn)生療效。

5.4其它

囊性纖維化(CF)是由于缺損囊性纖維性穿膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)而引起的一種人類遺傳病，其特點(diǎn)是粘液腺功能不足，粘液中含有異常糖蛋白，因而粘液的粘度不正常而影響呼吸道上皮和消化道上皮，引起慢性感染，直至死亡［16］。針對(duì)CF的基因治療研究已進(jìn)行了多年，試用過(guò)各種載體，效果不甚理想。最近，Goldman等［5］用HIV-1載體進(jìn)行了嘗試，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，導(dǎo)入CFTR基因后CF缺陷可被糾正。但他們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，HIV-1載體轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖中的呼吸道上皮細(xì)胞效果較好，而對(duì)完全分化的上皮細(xì)胞則效率很低。目前尚不完全清楚轉(zhuǎn)導(dǎo)受限的機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

色素性視網(wǎng)膜炎是一種遺傳性的進(jìn)行性視網(wǎng)膜退變，癥狀包括視野進(jìn)行性減小、夜盲、視網(wǎng)膜色素沉著等。研究發(fā)現(xiàn)，將視桿細(xì)胞cGMP磷酸二酯酶γ亞單位基因?qū)敫泄饧?xì)胞有可能糾正視網(wǎng)膜退變，但導(dǎo)入時(shí)機(jī)以及導(dǎo)入多少感光細(xì)胞才能保持視覺(jué)功能尚不清楚。由于成熟的視網(wǎng)膜細(xì)胞絕大部分為終末分化細(xì)胞，因此HIV-1載體為視網(wǎng)膜病變的研究與治療帶來(lái)了希望［4］。

6存在問(wèn)題

盡管HIV-1載體的研究有了很大進(jìn)展，但距離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。首先，重組病毒的滴度還不夠高，除Naldini等報(bào)道的結(jié)果外，其余均在101TU/ml～103TU/ml之間，難以達(dá)到體內(nèi)應(yīng)用的需要；其次，由于HIV復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì)，要像目前常用的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細(xì)胞十分困難，已建立的包裝細(xì)胞［17，18］均不理想。據(jù)報(bào)道，Vpr是一種使細(xì)胞進(jìn)入靜止期的強(qiáng)誘導(dǎo)劑［19，20］，也是建立包裝細(xì)胞的主要障礙之一。如果確如前文所述，包裝質(zhì)粒中的vpr基因并非必需、去除后不影響載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，則建立穩(wěn)定的包裝細(xì)胞是大有希望的。

在保證HIV-1載體的安全性上，迄今已做了種種努力，要產(chǎn)生有復(fù)制力的HIV，必須在不同的質(zhì)粒上發(fā)生多次非同源重組事件。即使如此，一旦用于人體試驗(yàn)，仍然不能打消人們對(duì)感染有復(fù)制力的HIV-1的顧慮。更為謹(jǐn)慎的做法是，以非人類的慢病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建載體，如猴免疫缺損病毒(SIV)、豬和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV)、馬傳染性貧血病病毒等，而目前這些工作尚屬空白。

(本文承蒙侯云德院士審閱，特此致謝)

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