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【摘要】最近研究表明，青光眼患者眼壓升高及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷和死亡可能與某些相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及功能異常有關(guān)，因此，基因治療作為一種新的治療方法已逐漸在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用,為青光眼的防治提供了廣闊的前景。本文對(duì)目前進(jìn)行的基因治療研究進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】青光眼基因治療

Advancesingenetherapyforglaucoma

AbstractPreviousstudiesinmoleculargeneticshaveindicatedinglaucomaelevatedintraocularpressureanddamageofdeathofretinalganglioncellsmayberelatedtotheabnormalityofrelatedgene.Sogenetherapyhasbeengraduallyappliedinmedicaldomainasakindofnewtreatmentmethod,itprovidesextensiveprospectforthepreventionandcureofglaucoma.Thispaperreviewsadvancesingenetherapyforglaucoma.

·KEYwordS:glaucoma;genetherapy

0引言

青光眼是一組以進(jìn)行性視神經(jīng)損害和神經(jīng)元喪失為特征的眼部疾患。青光眼作為全世界第二位的致盲眼病,其有效防治越來(lái)越成為防盲治盲和公共衛(wèi)生工作的重點(diǎn)。眼壓升高和缺血是引起青光眼性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncells，RGCs)喪失的兩個(gè)刺激因素，高眼壓將直接損害視神經(jīng)軸突，并導(dǎo)致RGC不可逆性喪失。由于RGC死亡的確切分子機(jī)制還不是很清楚，目前還沒(méi)有有效的治療來(lái)預(yù)防嚴(yán)重青光眼患者的視功能喪失[1]。目前青光眼的治療仍以降低眼壓為主,但常用的藥物存在較嚴(yán)重的并發(fā)癥。而手術(shù)治療如濾過(guò)性手術(shù),效果不是很理想，一方面很多患者術(shù)后因發(fā)生濾過(guò)泡疤痕化而影響眼壓控制，另一方面一些患者即使眼壓已經(jīng)控制達(dá)正常范圍,他們的視功能損害仍繼續(xù)進(jìn)展,且無(wú)有效的治療方法。

基因治療是用基因工程技術(shù),對(duì)基因進(jìn)行改建、修飾和置換,或?qū)Ξ惓；虮磉_(dá)進(jìn)行干預(yù)以治療疾病的方法。其含義是從導(dǎo)入基因糾正遺傳病的基因缺陷,擴(kuò)大到導(dǎo)入外源基因達(dá)到治療效果的所有治療方法。轉(zhuǎn)基因技術(shù)適合治療青光眼，在于青光眼的慢性過(guò)程和比較明確的病理學(xué)基礎(chǔ)[2]。解剖學(xué)、遺傳學(xué)和基因表達(dá)圖譜已經(jīng)證明轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療青光眼，包括改善房水引流、減少濾過(guò)泡疤痕形成和保護(hù)RGC已成為可能。本文對(duì)青光眼基因治療研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1轉(zhuǎn)基因治療青光眼的靶組織

青光眼基因療法特有的靶組織結(jié)構(gòu)或細(xì)胞類(lèi)型包括小梁網(wǎng)(trabecularmeshwork,TM)、睫狀上皮(ciliaryepithelium,CE)、睫狀肌(ciliarymuscle,CM)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncells,RGCs)和Müller細(xì)胞(MCs)。小梁網(wǎng)位于前房角，是一種由不同內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)以特定結(jié)構(gòu)形成的海綿狀組織;它負(fù)責(zé)維持房水流出的阻力和保持眼球的形狀。睫狀上皮包括兩種緊密連接的覆蓋在睫狀突的細(xì)胞層，外層細(xì)胞面向后房，是非色素性上皮，主要分泌房水。房水產(chǎn)生后，進(jìn)入前房，通過(guò)小梁細(xì)胞和內(nèi)層Schlemm管壁離開(kāi)眼球而進(jìn)入靜脈系統(tǒng)。睫狀肌緊鄰睫狀上皮和小梁網(wǎng)。一旦睫狀肌收縮，晶狀體調(diào)節(jié)力增加，小梁網(wǎng)的構(gòu)型發(fā)生變化，房水流出易度增加。RGCs，視網(wǎng)膜的最內(nèi)層細(xì)胞，通過(guò)其軸突將光信號(hào)傳導(dǎo)至大腦，其軸突組成了視神經(jīng)。許多刺激傷害，通常是眼壓升高引起RGCs損害和凋亡，最后導(dǎo)致視神經(jīng)纖維喪失[3]。

2青光眼基因治療的有關(guān)載體

能將遺傳物質(zhì)傳送入視網(wǎng)膜或RGC的載體系統(tǒng)至少應(yīng)具備以下四種生物學(xué)特性：(1)能對(duì)準(zhǔn)目標(biāo)的特有細(xì)胞類(lèi)型，其目標(biāo)或者是受染細(xì)胞，或者是鄰近細(xì)胞，例如，引入分泌性治療藥物的基因。(2)基因傳導(dǎo)應(yīng)該有效，即現(xiàn)有的載體滴度和有限的劑量可以很安全地注射入各種視網(wǎng)膜間隙，傳代基因能有效地復(fù)制，并進(jìn)入足夠多的靶細(xì)胞，允許治療藥物在視網(wǎng)膜特定部位進(jìn)行表達(dá)。(3)載體相關(guān)表達(dá)應(yīng)該恒定并適當(dāng)?shù)爻掷m(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。(4)載體本身毒性應(yīng)該很低，這包括藥理學(xué)毒性、針對(duì)傳導(dǎo)基因產(chǎn)物、輸入載體或者源于輸入載體的任何表達(dá)基因的局部和全身免疫反應(yīng)。

目前用于青光眼轉(zhuǎn)基因治療，并滿足這些生物學(xué)特性的載體可分為病毒和非病毒兩種方法：

2.1病毒方法病毒方法是利用載有目的基因的復(fù)制缺陷病毒感染靶細(xì)胞。

2.1.1相關(guān)的DNA病毒載體⑴腺病毒(adenovirus，Ad)載體：最初的腺病毒載體能夠搭載大約8kb的傳代DNA。幾種早期的病毒基因的附加失活作用產(chǎn)生的復(fù)制缺陷病毒載體能夠在傳導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞中生長(zhǎng)并形成很高的滴度?；虮磉_(dá)通常在接種后24h內(nèi)出現(xiàn)，這使得在動(dòng)物模型中進(jìn)行研究變得非常方便。重組的腺病毒由于宿主對(duì)輸入的病毒顆粒本身和因?yàn)楦腥径a(chǎn)生的大量病毒蛋白質(zhì)的反應(yīng)，故具有相對(duì)的免疫原性。然而，眼部的相對(duì)免疫特性使得暫時(shí)性的腺病毒相關(guān)的基因治療仍然有效。由于重組的腺病毒DNA并不能穩(wěn)定地整合入宿主染色體的DNA中，所以其在眼組織中傳達(dá)的基因表達(dá)是暫時(shí)性的，一般保存1～3mo。如果其引起的免疫反應(yīng)能進(jìn)一步減輕的話，特殊的短期基因治療干預(yù)，將是有利時(shí)機(jī)[4]。⑵腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus，AAV)載體：通常這種病毒感染人類(lèi)，并不引起已知的疾病。它是一種小的單鏈DNA病毒，它本身只產(chǎn)生非常小的蛋白質(zhì)，因此具有相對(duì)的非免疫原性。如果沒(méi)有與野生型輔助病毒(通常是人類(lèi)腺病毒)一同感染，野生型AAV能穩(wěn)定地整合入人類(lèi)19號(hào)染色體的特定位點(diǎn)，并建立隱匿性感染。相反，由于在重組的AAV(rAAV)中刪除了這種特殊整合位點(diǎn)所必需的病毒rep蛋白質(zhì)，目前的AAV載體并不具備這種特性。然而，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，rAAV能在長(zhǎng)達(dá)數(shù)周或數(shù)月內(nèi)緩慢地整合入隨機(jī)的染色體位點(diǎn)，這取決于靶細(xì)胞，也使得長(zhǎng)期性的、或者是永久性的傳導(dǎo)成為可能。與重組的腺病毒不一樣，rAAV似乎能傳導(dǎo)正常的RGC和光感受器細(xì)胞與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。但是，當(dāng)前的rAAV具有兩大缺陷：①它限定了搭載的DNA不能超過(guò)4.8kb。盡管AAV適合于目前的可用于視神經(jīng)保護(hù)治療的絕大部分基因，但是，只有有限的空間用于調(diào)節(jié)成分，這是為精確地協(xié)調(diào)和控制基因表達(dá)所必需的，才能起作用。②如果rAAV整合確實(shí)是隨機(jī)的話，理論上就存在插入的基因突變。這使得臨床前期研究比其他載體更加費(fèi)時(shí)，而且不可能很快用于視網(wǎng)膜變性疾病的動(dòng)物模型中。目前一種新的，更加有效的rAAV包裝技術(shù)能很好地避免低病毒滴度和野生型腺病毒輔助劑的低水平污染引起的一些早期問(wèn)題[5]。⑶單皰病毒(herpessimplevirus,HSV)載體：HSV能有效地將有益基因轉(zhuǎn)入青光眼相關(guān)的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞。在猴和嚙齒類(lèi)，通過(guò)前房注射，在TM和CE轉(zhuǎn)染效率很高，而其他細(xì)胞如虹膜色素上皮細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低。只有在CMV啟動(dòng)子和HSV載體一起進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，基因表達(dá)最多持續(xù)10d[6,7]。HSV在RGCs亦能產(chǎn)生有效的轉(zhuǎn)染，但在靈長(zhǎng)類(lèi)，其傳導(dǎo)位置只局限于傳送部位[3]。

2.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)載體其優(yōu)點(diǎn)是目的基因可以整合到染色體上,可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá),而且轉(zhuǎn)移效率高。但目前應(yīng)用于基因療法的大部分RNA病毒載體都是源于鼠類(lèi)白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒。它不能轉(zhuǎn)染非增殖期的細(xì)胞,所以不適用于角膜內(nèi)皮及視網(wǎng)膜等組織的基因轉(zhuǎn)染。相反，基于人類(lèi)免疫缺陷病毒(humanimmuno-deficiencyviruses，HIV)和猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyviruses，SIV)的慢病毒載體(lentiviralvectors)，編碼諸如vpr之類(lèi)的蛋白質(zhì)，允許細(xì)胞核輸入病毒基因組，而不影響相伴隨的有絲分裂。慢病毒載體(lentiviralvectors)：這種載體通常是假表型的，即為包被另外一種病毒蛋白質(zhì)作準(zhǔn)備。能夠以這種方式搭載慢病毒，并具有這種特性的細(xì)胞通常是CD4+T細(xì)胞，允許慢病毒感染多種細(xì)胞。慢病毒含有泡狀口腔炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV-G)的糖蛋白，已經(jīng)成功地用于鼠類(lèi)視網(wǎng)膜。在一次接種后能感染整個(gè)視網(wǎng)膜，并能至少穩(wěn)定3mo。它需要將染色體整合，才能獲得基因表達(dá)，這提示病毒載體能在RGC進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)期傳導(dǎo)。但是這種載體具有以下幾種技術(shù)缺陷：①任何基于人類(lèi)的免疫缺陷病毒的載體系統(tǒng)在可以用于人類(lèi)之前，都必須證明不會(huì)產(chǎn)生野生型人類(lèi)免疫缺陷病毒。許多新近的基于病毒載體已經(jīng)刪除了原來(lái)的人類(lèi)免疫缺陷病毒基因組的重要節(jié)段，因此，進(jìn)一步減少了產(chǎn)生感染性病毒的危險(xiǎn)性。②按照目前的滴度，需要30～100μL重組病毒才能達(dá)到整個(gè)人類(lèi)視網(wǎng)膜。最近，病毒顆粒的穩(wěn)定性和濃縮技術(shù)已得到明顯改善，因此，容量問(wèn)題將會(huì)被解決。③需要關(guān)心的是基于人類(lèi)免疫缺陷病毒載體的整合問(wèn)題。整合位點(diǎn)似乎是隨機(jī)的，因此，可能存在整合所導(dǎo)致的基因突變。很可能需要更精細(xì)和更大的啟動(dòng)子以平衡轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性基因的長(zhǎng)期表達(dá)。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)已被認(rèn)為是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)子，并強(qiáng)化了近端啟動(dòng)子不僅僅只是一個(gè)重要想法的思想。病毒載體整合入基因組的位點(diǎn)往往影響治療性基因的表達(dá)，所以，下一代的啟動(dòng)子應(yīng)該含有開(kāi)放性染色質(zhì)的調(diào)節(jié)子，諸如位點(diǎn)控制元素，它可以在一些情況下以暫時(shí)性的方式上調(diào)或下調(diào)治療性基因產(chǎn)物水平。繼續(xù)研究視網(wǎng)膜細(xì)胞特殊的啟動(dòng)子，已被認(rèn)為是基因療法的必要進(jìn)展[8]。Lotery等[9]通過(guò)玻璃體切割和視網(wǎng)膜下注射將重組的貓免疫缺陷病毒(recombinantfelineimmuno-deficiencyvirus,rFIV)載體將β半乳糖酶基因轉(zhuǎn)染入cynomolgus猴視網(wǎng)膜。結(jié)果表明光感受器和Müller細(xì)胞有極好的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。局部炎癥反應(yīng)只局限在注射部位。電生理檢查表明，視功能不因載體注射而受到明顯影響。這提示視網(wǎng)膜下應(yīng)用rFIV載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)非靈長(zhǎng)類(lèi)視網(wǎng)膜各種類(lèi)型的視網(wǎng)膜細(xì)胞，rFIV載體具有潛在的治療作用，并可用于人眼的基

因療法。Loewen等[10]采用視網(wǎng)膜下注射2μL的貓免疫缺陷病毒(felineimmuno-deficiencyvirus,FIV)或腺病毒載體，比較兩種載體行視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期表達(dá)情況，在劑量-反應(yīng)研究中，2×105傳導(dǎo)單位(transducingunits,TU)中，兩種載體在視網(wǎng)膜的傳導(dǎo)范圍一致;但在長(zhǎng)期表達(dá)研究中，在不同的時(shí)間點(diǎn)(1wk;1，3，6，12和16mo)FIV載體的表達(dá)程度(grade)均比腺病毒載體高。但大部分腺病毒注射眼均出現(xiàn)了局部巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的聚集和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的破壞。結(jié)果表明，慢病毒載體經(jīng)隨訪16mo仍能持久表達(dá)，可用于慢性視網(wǎng)膜疾病的基因治療。

2.2非病毒方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)法和受體介導(dǎo)法等。與病毒方法相比,沒(méi)有致癌性,也排除了病毒感染,缺點(diǎn)是整合率低。近年來(lái),人們對(duì)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移方法有了較多的研究,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有很大提高,如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin及其新一代產(chǎn)品Lipofectimine。Hangai等[11，12]用其特殊的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層取得了較好的轉(zhuǎn)染效果,但基因表達(dá)時(shí)間較用AV載體明顯短,注射后30d時(shí)基因表達(dá)已經(jīng)十分微弱或消失。由于脂質(zhì)體介導(dǎo)法還具有安全、方便的優(yōu)點(diǎn),所以是一種很有前途的目的基因運(yùn)載體系。Hart等[13]用受體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜組織也取得了較好效果。

3青光眼的基因治療效果

盡管大多數(shù)青光眼的遺傳基因尚不清楚，但編碼眼壓降低和/或視神經(jīng)保護(hù)基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)可改變相關(guān)細(xì)胞的生理狀態(tài)和阻止發(fā)病。與其他慢性疾病一樣，應(yīng)用基因治療青光眼將提供長(zhǎng)期有效的治療效果。

3.1改善房水循環(huán)目前可用于處理眼前節(jié)組織降低眼壓的藥物必須每天用藥，那么順從性是個(gè)主要問(wèn)題?；虔煼梢詼p輕這個(gè)問(wèn)題。

3.1.1減少房水的生成房水的生成主要靠睫狀突非色素上皮逆濃度梯度,將Na+泵入后房。睫狀突非色素上皮細(xì)胞緊密連接,形成血-房水屏障,在Na+/K+ATP酶的作用下,Na+由細(xì)胞主動(dòng)分泌入后房,這是一個(gè)耗能過(guò)程,且與HCO3-和Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)。而通過(guò)α2，β2腎上腺素能受體可調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性,繼而影響Na+/K+ATP酶的活性[14]。目前許多藥物都有抑制與房水生成相關(guān)的酶或離子泵的作用,如Na+/K+ATP酶對(duì)烏巴因(ouabain)敏感,可被其抑制而減少房水的生成;目前應(yīng)用較多的β2受體阻滯劑,其作用機(jī)制就是抑制睫狀體上皮的離子泵或酶的活性,引起第二信使的改變從而抑制房水的生成。以上研究結(jié)果提示,可以通過(guò)影響與房水生成相關(guān)的幾個(gè)步驟減少房水的生成。根據(jù)房水的生成原理,目前至少可由以下幾個(gè)途徑通過(guò)基因敲除的方法減少房水的生成：⑴基因敲除與房水生成相關(guān)的酶或相關(guān)的離子通道;⑵基因敲除腺苷酸環(huán)化酶減少房水的生成;⑶基因敲除G蛋白,減少房水的生成。

3.1.2疏通房水流出通道增加房水的排出將外源基因?qū)胄×壕W(wǎng)以治療青光眼，Borras等[15]將外源基因?qū)胄×壕W(wǎng)細(xì)胞中,基因可表達(dá)7d。Budenz等[16]將含有l(wèi)acZ基因的腺病毒載體注入前房和玻璃體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)小梁網(wǎng)細(xì)胞可表達(dá)持續(xù)14d。使用灌注眼培養(yǎng)系統(tǒng),Borras等[17]將管蛋白(tubulin)基因?qū)胄×壕W(wǎng)細(xì)胞中,可降低眼壓。

3.2視神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)性治療[18]青光眼性RGCS凋亡的激發(fā)因素主要有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的剝奪和興奮性毒素一氧化氮的毒性作用。高眼壓或低血流灌注壓導(dǎo)致缺血缺氧等，使RGC軸漿流中斷，靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子供應(yīng)中斷，同時(shí)興奮性毒素大量產(chǎn)生，激活誘導(dǎo)凋亡的基因作用于細(xì)胞表面受體，啟動(dòng)RGC凋亡程序。已有研究表明重復(fù)眼內(nèi)注射神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能暫時(shí)性拯救因軸突損傷導(dǎo)致的RGC死亡。采用基因療法轉(zhuǎn)染這些營(yíng)養(yǎng)因子，能克服重復(fù)注射帶來(lái)的并發(fā)癥。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是一種重要的RGC存活因子。DiPolo等[19]通過(guò)玻璃體腔內(nèi)BDNF表達(dá)的腺病毒載體能暫時(shí)性延緩視神經(jīng)橫斷性損傷后RGC死亡。但是基于腺病毒載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)有效時(shí)間相對(duì)較短，而且其本身易引起炎癥反應(yīng)。腺相關(guān)病毒(AAV)載體能夠在視網(wǎng)膜進(jìn)行長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，引起的眼部炎癥反應(yīng)很輕微。Martin等[20]通過(guò)采用532nm二極管激光處理大鼠小梁網(wǎng)引起中等程度的慢性眼壓升高，只導(dǎo)致特異性的RGC喪失，而不損害其他視網(wǎng)膜層。他們采用獨(dú)創(chuàng)的AAV-BDNF結(jié)合土撥鼠肝炎逆轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元素(woodchuckhepatitispost-transcriptionalregulatoryelement,WPRE),單次玻璃體腔內(nèi)病毒注射2wk內(nèi)就很容易在大鼠RGC層神經(jīng)元產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)性青光眼4wk后，玻璃體腔內(nèi)注射AAV-BDNF-WPRE與單純注射生理鹽水或不含BDNF的對(duì)照病毒相比，能明顯增加RGC的存活率(軸突計(jì)數(shù))，進(jìn)一步支持神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)療法可作為青光眼降低眼壓的補(bǔ)充治療的潛在可行性。

Dingwell[21]等證實(shí)堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)在RGC生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中是一種潛在的刺激因子。但Cui[22]在視神經(jīng)顱內(nèi)段軸性損傷后，采用眼內(nèi)注射bFGF蛋白質(zhì)未能顯示RGC再生。據(jù)推測(cè)，這是由于bFGF在體內(nèi)的半衰期很短，在眼內(nèi)持續(xù)時(shí)間有限。Sapieha等[23]采用視神經(jīng)微壓榨傷(micro-crushlesion)制作視神經(jīng)損傷模型，用重組AAV將bFGF基因轉(zhuǎn)入成年SD大鼠玻璃體腔，以利于bFGF的持久釋放。與對(duì)照組的神經(jīng)相比，F(xiàn)GF-2基因轉(zhuǎn)染后，視神經(jīng)軸突從病變部位向后的數(shù)量要多10倍，這種上調(diào)反應(yīng)與FGF受體-1表達(dá)相關(guān)。bFGF轉(zhuǎn)基因表達(dá)只對(duì)受損的RGC起暫時(shí)性的保護(hù)作用，而且這種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)軸突延伸并不能代表神經(jīng)元存活數(shù)量的增加。

近年來(lái)，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNDF)被證明是能改善受損的RGC的存活與再生最有前途的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一。VanAdel等[24]采用視神經(jīng)橫斷性損傷作為在體模型，評(píng)價(jià)具有自我失活的復(fù)制缺陷的慢病毒相關(guān)的載體轉(zhuǎn)染人類(lèi)睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(SIN-PGK-CNFT)對(duì)成年大鼠RGC軸突存活率的影響。他們采用單次玻璃體內(nèi)注射慢病毒編碼的人CNTF(LV-CNTF)基因或細(xì)菌β-半乳糖酶(LV-LacZ)作為對(duì)照組，在大鼠視神經(jīng)軸性損傷后14d與21d檢測(cè)RGC的存活情況。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，用lentiviral作為載體應(yīng)用CNTF，能明顯增強(qiáng)RGC的存活，而且效果比單純玻璃體內(nèi)注射重組人CNTF要好。

色素上皮源性因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)，是一種50kDa蛋白質(zhì)，由人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌。已經(jīng)證明PEDF是一種有希望的內(nèi)源性新生血管形成抑制劑和神經(jīng)保護(hù)蛋白質(zhì)。Takita等[25]采用前房?jī)?nèi)灌注生理鹽水，將大鼠眼壓升高至110mmHg，持續(xù)60min，制作壓力誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜缺血-再灌注模型。在模型制作前4d玻璃體腔內(nèi)注射腺病毒載體表達(dá)的PEDF(AdPEDF.11)顆粒。結(jié)果表明，節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞密度明顯多于對(duì)照組(AdNull.11);但凋亡細(xì)胞數(shù)(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞)明顯少于對(duì)照組。提示腺病毒載體相關(guān)的眼內(nèi)PEDF表達(dá)能明顯增加視網(wǎng)膜缺血-再灌注(急性高眼壓)損傷神經(jīng)元的存活率，這種保護(hù)作用可能源于抑制缺血誘導(dǎo)的凋亡，并認(rèn)為轉(zhuǎn)基因方法能直接干擾因視網(wǎng)膜缺血所導(dǎo)致的細(xì)胞程序化死亡。

原癌基因bcl-2的過(guò)度表達(dá)可以減少細(xì)胞凋亡，但它是否影響軸突再生尚無(wú)定論。bcl-2在胚胎感覺(jué)神經(jīng)元的體外實(shí)驗(yàn)以及生后受損RGC的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，但卻不能誘導(dǎo)新生小鼠軸突重建。在成年嚙齒類(lèi)動(dòng)物，即使去除了髓鞘相關(guān)抑制分子或加入周?chē)窠?jīng)移植物，bcl-2過(guò)度表達(dá)仍不能進(jìn)一步加強(qiáng)軸突再生。Bcl-XL是bcl-2家族的一個(gè)成員，去除該基因可增加發(fā)育性細(xì)胞死亡，而過(guò)度表達(dá)可保護(hù)生后及成年神經(jīng)元免于創(chuàng)傷、缺氧、代謝等損傷[26]。Kretz等[26]將Bcl-XL通過(guò)腺病毒載體在體外、體內(nèi)受損的RGC中過(guò)度表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)能使培養(yǎng)的RGC軸突的數(shù)目、總長(zhǎng)度增加，活體視網(wǎng)膜內(nèi)RGC的軸突可以長(zhǎng)入鄰近的視神經(jīng)斷端，但不能通過(guò)瘢痕形成的區(qū)域。其中機(jī)制有待闡明，Bcl-2和Bcl-XL很可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和再生的通路而起作用的。

3.3抑制濾過(guò)泡的瘢痕化[27,28]眼壓升高是青光眼的主要危險(xiǎn)因素，施行手術(shù)降低眼壓仍然是治療青光眼的主要手段。濾過(guò)性手術(shù)是目前常用的抗青光眼手術(shù)，但術(shù)后濾過(guò)道的疤痕形成將導(dǎo)致手術(shù)失敗，因此常常在術(shù)中或術(shù)后聯(lián)合應(yīng)用抗代謝藥物，如絲裂霉素C(mitomycin,MMC)和5-氟尿嘧啶以減少濾過(guò)道的疤痕形成。但它們同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生意想不到的副作用，如低眼壓和由于細(xì)胞破壞導(dǎo)致的組織變性?；虔煼茴A(yù)防青光眼濾過(guò)性手術(shù)后增殖的傷口愈合反應(yīng)。Perkins等[29]給新西蘭白兔施行

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全層鞏膜切除術(shù)，并在以角膜緣為基底的結(jié)膜瓣下放置浸有含人p21基因(rAd.p21)的復(fù)制缺陷的重組腺病毒、非特異的綠熒光蛋白標(biāo)記基因(greenfluorescentprotein，GFP)、β-半乳糖酶(beta-galactosidase)、MMC(0.5g/L)及平衡鹽溶液的纖維素海綿5min。結(jié)果表明，經(jīng)rAD.p21基因處理的筋膜成纖維細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性抑制。但MMC引起薄壁濾過(guò)泡、前房積膿等并發(fā)癥，在rAD.p21基因處理組未發(fā)現(xiàn)。兩組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均可見(jiàn)功能性濾過(guò)泡。這提示rAD.p21基因療法能為青光眼濾過(guò)性手術(shù)提供有效的抗纖維增殖作用，但沒(méi)有MMC相關(guān)的并發(fā)癥發(fā)生。為進(jìn)一步了解rAD.p21基因的適應(yīng)證，Wen等[30]研究了兔眼結(jié)膜局部轉(zhuǎn)染腺病毒p21基因后，載體傳送、靶組織的轉(zhuǎn)基因表達(dá)、炎癥反應(yīng)、非靶組織的生物分布和免疫反應(yīng)等特征。結(jié)果表明，結(jié)膜下注射rAd.p21后，其生物分布只局限于眼組織;濾過(guò)性手術(shù)后，將rAd.p21轉(zhuǎn)染至結(jié)膜下，術(shù)后早期引起急性炎癥反應(yīng)，但到第14天時(shí)與安慰劑對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別。這些結(jié)果顯示，將基因局部轉(zhuǎn)染至結(jié)膜是一個(gè)非常合適的眼部基因轉(zhuǎn)染模型。

Heatley等[31]先采用重組腺病毒將人類(lèi)p21(WAF-1/cip-1)基因引入猴高眼壓眼，然后施行小梁切除術(shù)，結(jié)果表明經(jīng)p21處理眼造瘺口在功能上、組織學(xué)上均保持開(kāi)放，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在對(duì)照眼上出現(xiàn)絲裂霉素C治療的副作用。Yoon等[32]在正常兔眼施行青光眼濾過(guò)性手術(shù)后，結(jié)膜下注射2μghumanRAD50(hRAD50)基因，采用光鏡和電鏡比較hRAD50處理組與MMC處理組和正常對(duì)照組的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果表明，局部應(yīng)用RAD50的抗纖維增殖作用與MMC相同，但沒(méi)有結(jié)膜上皮基質(zhì)層的損害，提示hRAD50可作為一種可能的抗纖維增殖藥物用于青光眼濾過(guò)性手術(shù)，但需要更進(jìn)一步研究其可能存在的全身并發(fā)癥。

4與青光眼組織相關(guān)的潛在的靶基因

4.1小梁網(wǎng)①細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白：通過(guò)破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，刺激房水流出增加;②Myocilin基因：高度表達(dá)野生型位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)突變位點(diǎn);③金屬蛋白酶：細(xì)胞外基質(zhì)重新塑型[3]。

4.2睫狀上皮①調(diào)節(jié)房水生成24h節(jié)律的基因：減少夜間房水生成增加所導(dǎo)致的潛在性的危險(xiǎn)眼壓水平。②β腎上能受體增進(jìn)睫狀體細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)的潛能，抑制房水生成。③減少房水生成的其他基因(神經(jīng)多肽鏈)：調(diào)整小梁網(wǎng)和睫狀肌的功能[3]。

4.3睫狀肌細(xì)胞①X基因：上調(diào)前列腺素的合成;②金屬蛋白酶：產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，增加葡萄膜鞏膜通道房水流出[3]。

4.4視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞①神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(TrkB)：增加RGC對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子反應(yīng)的潛能;②神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素基因(BcIX)：增加內(nèi)源性抗凋亡基因產(chǎn)物水平以拮抗BAX功能;③Bax基因：反義結(jié)構(gòu)以減少BAX蛋白水平;④Hsp70/72基因：增進(jìn)RGC對(duì)內(nèi)源性刺激反應(yīng)能力，以抵抗損害性刺激[3]。

4.5Müller細(xì)胞①GLAST：上調(diào)內(nèi)源性谷氨酸鹽運(yùn)輸體，增進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)谷氨酸鹽水平;②神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素基因：為RGC提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素的替代資源[3]。

5青光眼基因治療存在的問(wèn)題和展望

基因治療最常見(jiàn)的負(fù)面反應(yīng)表現(xiàn)在前房?jī)?nèi)出現(xiàn)的主要由單核細(xì)胞浸潤(rùn)組成的炎癥反應(yīng)。這種反應(yīng)在靈長(zhǎng)類(lèi)比嚙齒類(lèi)更常見(jiàn)，至少發(fā)生在HSV載體中。在注射高濃度腺病毒載體時(shí)，兔眼和猴眼都可能出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，這可能與載體病毒誘導(dǎo)的炎癥前細(xì)胞激酶的作用有關(guān)。而且，這種炎癥反應(yīng)是劑量依賴(lài)性的，但AAV和LV載體并不誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

目前,青光眼基因治療在眼科領(lǐng)域尚處于實(shí)驗(yàn)起始階段,既面臨基因治療普遍碰到的問(wèn)題,也有青光眼治療中的特殊問(wèn)題,還有許多理論、技術(shù)等方面的問(wèn)題亟待解決。我們需要更好地理解小梁細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞骨架改型和細(xì)胞信號(hào)事件;更好地理解房水的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)，睫狀上皮釋放的能改變小梁網(wǎng)功能的因子;更好地理解RGC在經(jīng)受各種刺激和升高與不升高眼壓條件下細(xì)胞死亡的激活通路;更好地理解機(jī)體對(duì)各種載體系統(tǒng)的內(nèi)在的和抗原特性的免疫反應(yīng);更好地理解這些反應(yīng)在嚙齒類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的差別以減輕這些反應(yīng)類(lèi)型。同時(shí)需要能夠模仿導(dǎo)致眼壓升高的小梁網(wǎng)和睫狀上皮變化的動(dòng)物模型以檢測(cè)基因治療的效果。努力確認(rèn)與青光眼相關(guān)的其他基因?qū)楦玫幕蛑委煵呗蕴峁┲匾€索。最后，關(guān)鍵是要理解為什么源于不同載體的異位基因表達(dá)會(huì)在不同的眼組織細(xì)胞中終止;關(guān)鍵是要證實(shí)啟動(dòng)子或其他基因表達(dá)元件能夠提供長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)[3]。

總之，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展與基因工程的日新月異,過(guò)去的困難現(xiàn)已迎刃而解,相信在不久的將來(lái)，青光眼基因治療一定會(huì)在臨床上逐步展現(xiàn)其優(yōu)越性。

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